CARM1与HIF1A互作结合至多个靶点启动子

《Protein Cell》解读：CARM1与HIF1A互作结合至多个靶点启动子，协调促进三阴性乳腺AI（TNBC）的进展

乳腺AI 就占女性AI症的31%。女性乳腺AI 发病率一直在缓慢上升。三阴性乳腺AI （TNBC）恶性程度更高，且无有效治LIAO ，预后差。精氨酸甲基化是一种关键的翻译后修饰（PTM），参与各种细胞过程。然而，关于CARM1在TNBC中的功能知之甚少。

2024年10月，中国医学科学院和首都医科大学基础医学院团队联合在Protein Cell（IF=13.6）上发表了题为“CARM1 drives triple-negative breast cancer progression by coordinating with HIF1A”的研究成果。揭示CARM1在TNBC中AI 变的分子基础及其有效的天然抑制剂，可能为AI症治LIAO 提供新的思路和药物。

图形摘要：

Highlights如下：

1）CARM1在乳腺AI 样本中高表达，与组织学分级呈正相关；

2）CARM1促进TNBC进展；

3）CARM1与HIF1A协同促进TNBC的进展；

4）CARM1由HIF1A募集，占据CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子，这些基因在细胞周期、HIF-1信号通路、Wnt信号通路、VEGF信号通路中起关键作用，从而调节TNBC细胞的增殖和侵袭。

临床相关性：

CARM1在乳腺AI 样本中高表达。

功能研究：

过表达CARM1在体内、外促进TNBC细胞的增殖、侵袭、EMT和干细胞潜能，CARM1敲减则相反。

机制研究：

（1）鉴定CARM1的全基因组转录的转录靶标

通过anti-CARM1 ChIP-seq实验，共鉴定出17,749个carm1特异性结合峰和4,866个独特的启动子基因（图1a）。KEGG分析发现，这些基因参与HIF-1、Wnt、VEGF等信号通路（图1b）。ChIP-qpcr检测显示，CARM1在CARM1、CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1, MAT2A、VEGFA和Vimentin等启动子上强富集，验证了ChIP-seq结果（图1c）。对所选基因进行anti-H3R17me2a和anti-H3R26me2a ChIP-qpcr分析，显示H3R17me2a和H3R26me2a占据了目标启动子（图1d）。进一步表明，这些启动子被CARM1占据。敲减CARM1进行RNA-seq，KEGG分析显示Wnt、HIF-1和VEGF信号通路富集（图1e-f），这与ChIP-seq数据一致。此外，ChIP-seq中的启动子基因（P < 0.001）与RNA-seq中下调的基因重叠（图1g）。RT-qPCR和WB验证了CARM1敲低引起的变化（图1h-i）。

图1 鉴定CARM1的全基因组转录的转录靶标（Ref. Fig 3）

（2）CARM1与HIF1A存在关联并直接相互作用

第一步，筛选CARM1的互作蛋白

通过anti-Flag-CARM1 IP-MS鉴定与CARM1相互作用的蛋白，分析显示CARM1与HIF1A存在关联（图2a）。

第二步，验证CARM1与HIF1A相互作用

在常氧和缺氧条件下，进行Co-IP分析，CARM1和HIF1A相互作用（图2b-e）。此外，GST pulldown实验也证实CARM1与HIF1A互作（图2f-g）。

第三步，确定CARM1与HIF1A互作具体的位置

构建截短载体GST-CARM1-EVH1结构域（1-140 aa）、GST-CARM1-cat（141-480 aa）和GST-CARM1-c（481-608 aa），进行GST pulldown实验，表明CARM1的EVH1结构域负责与HIF1A相互作用（图2h-j）。此外，构建突变体进行GST pulldown实验，CARM1-∆EVH1（141-608 aa）不能与HIF1A相互作用，甲基转移酶失活的CARM1-R168A突变体不影响CARM1与HIF1A的相互作用（图2k），即这种相互作用不是一种翻译后修饰（PTM）的方式。同样，构建GST-HIF1A bHLH结构域（1-80 aa）、GST-HIF1A-PAS （81-350 aa）、GST-HIF1A-ODD （351-600 aa）和GST-HIF1A-TAD（601-826 aa）进行GST pulldown实验，显示HIF1A的TAD结构域负责与CARM1相互作用（图2l-m）。

第四步，CARM1与HIF1A互作结合CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子，调控其表达

接下来，用含缺氧反应元件（HREs）的pGL4.42载体转染细胞，检测常氧和缺氧条件下荧光素酶的活性（图2n），发现CARM1直接调控缺氧信号通路。BIOBASE分析显示CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子都具有潜在的HIF-1结合序列（图2o）。表明，CARM1直接与HIF1A相互作用，并调节其表达。

图2 CARM1与HIF1A存在物理关联并直接相互作用（Ref. Fig 4/S4）

（2）HIF1A招募CARM1促进下游基因转录激HUO 

HIF1A是一种激HUO 基因转录的转录因子。前面的研究显示CARM1与HIF1A互作，推测HIF1A/CARM1构成了一个激HUO 复合体，其功能是促进基因转录。

第一步，CARM1与HIF1A形成一个复合体，结合到下游靶标启动子区

为了探究HIF1A与CARM1互作的功能意义，分别在常氧和缺氧条件下，进行anti-CARM1和anti-HIF1A ChIP-qpcr实验，结果显示CARM1和HIF1A共同占据了这些靶标（图3a-b）。

第二步，CARM1与HIF1A形成一个复合体，结合到下游靶标启动子区

为了验证关于CARM1和HIF1A作为蛋白复合物占据目标启动子的假设，在缺氧条件下进行ChIP-qpcr实验。CARM1敲低明显降低了HIF1A与CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1、SIX1和VEGFA启动子的结合，反之亦然（图3c-f）。同时，在敲低CARM1或HIF1A后，所有目标启动子的H3R17me2a和RNA聚合酶II （RNA polymerase II, Pol II）水平均明显降低（图3c-f）。为了进一步验证假设，对六个具有代表性的靶基因CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1进行ChIP或ChIP-re-ChIP检测。可溶性染色质用anti-CARM1、HIF1A和H3R17me2a IP。以H3R17me2a为阳性对照。随后使用抗体对免疫沉淀物进行再免疫沉淀。结果表明，在沉淀物中，被anti-CARM1免疫沉淀的CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1启动子可以被anti-HIF1A或H3R17me2a再次免疫沉淀（图3g）。当使用anti-HIF1A或H3R17me2a进行初始ChIP检测时，获得类似的结果（图3g）。

即HIF1A和CARM1作为一个蛋白质复合物占据CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子。

另外，在缺氧条件下敲减HIF1A或CARM1下调CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的mRNA和蛋白水平表达（图3h）。综上所述，HIF1A和CARM1作为一个整体与靶基因启动子结合，并相互促进其募集和/或稳定，共同发挥转录激HUO 的功能。

图3 HIF1A招募CARM1促进下游基因转录激HUO （Ref. Fig 5）

结论：研究人员发现CARM1在乳腺AI 表达上调。功能上，CARM1上调与乳腺AI 进展相关，促进TNBC的增殖、侵袭、上皮间质转化和细胞干性。CARM1的全基因组分析表明，CARM1占据CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子，这些基因在细胞周期、HIF-1、Wnt、VEGF信号通路中起关键作用。机制上，CARM1与HIF1A互作，并由HIF1A募集，占据CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的启动子，从而调节TNBC细胞的增殖和侵袭。此外，CARM1的抑制剂鞣花酸可以通过直接抑制CDK4的表达来抑制TNBC的增殖和侵袭。该研究确定了CARM1AI 变的分子基础及其有效的天然抑制剂，为AI症治LIAO 提供新的思路和药物。