《PNAS》解读：糖基化修饰影响酶活和蛋白互作！

O-糖基化修饰（O-GlcNAcylation）是近年来发现的一种发生在细胞内蛋白丝氨酸或者苏氨酸残基上的单糖修饰，其失调与肿LIU等人类疾病的发生和发展密切相关。研究表明O-糖基化修饰在结直肠AI等多种肿LIU中明显上调，然而其促进肿LIU发生和发展的机制有待进一步的研究。

2024年10月24日，浙江大学易文和朱强共同通讯在PNAS（IF=9.4）上发表了题为“O-GlcNAcylation of enolase 1 serves as a dual regulator of aerobic glycolysis and immune evasion in colorectal cancer”的研究成果。揭示O-糖基化通过调控烯醇化酶（enolase 1, E***）来影响结直肠AI糖代谢以及免疫逃逸的机制，强调干预E***糖基化可以作为结肠AI临床治L的潜在策略。

图形摘要：

Highlights如下：

1）E***在肿LIU组织中的表达明显上调；

2）E***的酶活性是CRC细胞增殖和肿LIU生长所必需的；

3）E***在苏氨酸19（T19）上的O-糖基化增强了其酶活性；

4）抑制E***两个位点的糖基化能联合PD-L1单抗协同抑制结直肠肿LIU生长；

5）E***中丝氨酸249（S249）上的糖基化则抑制其与PD-L1的相互作用，并阻断泛素连接酶STUB1介导的PD-L1泛素化以及蛋白酶体降解，促进了 PD-L1蛋白表达，进而JI活 PD-1/ PD-L1 介导的肿LIU免疫逃逸。

临床相关性：

E***在肿LIU组织中的表达水平明显高于正常组织。

功能研究：

E***的T19 O-糖基化促进糖酵解和结直肠肿LIU生长；S249 O-糖基化抑制抗肿LIU活性并促进结直肠肿LIU生长。

机制研究：

（1）确定E***的O-糖基化修饰2个位点T19/S249，其中T19 O-糖基化影响其活性

第一步，E***存在O-糖基化修饰

越来越多的证据表明，O-糖基化会影响几种关键代谢酶的活性，从而调节细胞代谢。为了确定E***是否被O-糖基化修饰，化学酶标记实验发现OGA（O-连接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物体内唯YI水解蛋白质O-糖基修饰的糖苷酶。）抑制剂TMG或‌O-GlcNAc转移酶（OGT）过表达的情况下，O-糖基化信号明显升高（图1a）。随后用质量标记方法分析E***的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子与叠氮标记的糖蛋白结合，导致WB信号的分子移位。通过量化移位带和未移位带之间的强度之比，发现正常条件下，内源性E***的修饰率约为27%（图1b）。在不同浓度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清时，E*** O-糖基化水平呈剂量依赖性增加（图1c-e）。

第二步，鉴定E***上的O-糖基化位点

共表达HA-OGT和Flag-E***后，anti-Flag IP-MS质谱分析发现E***上鉴定到4个O-糖基化位点（T19、T26、S27和S249）。分别构建T19A、T26A、S27A和S249A突变体进行化学酶标记实验，T19A和S249A突变体明显降低了O-糖基化信号。双位点突变（T19A/S249A）使糖基化信号减少了约80%，表明T19和S249是E***上主要的糖基化位点（图1f-g）。此外，不同物种之间的序列比较表明，T19和S249都是进化保守的（图1h）。

第三步，E*** T19上的O-糖基化影响其酶活

E***敲除后外源表达WT、T19A或S249A E***发现，T19A突变体，而不是S249A突变体，表现出明显的活性降低（图1i），使用TMG或过表达OGT处理同样增加了WT和S249A E***的活性，但对T19A突变体没有明显影响（图1i）。另外，在大肠杆菌中的共表达OGT和UDP-GlcNAc合成途径中的关键酶，进一步验证了该结果（图1j）。表明E*** T19上的O-糖基化影响其酶活。

第四步，T19 O-糖基化促进形成E***二聚体增加E***活性

T19糖基化如何调控E***的活性？酶动力学研究发现，在OGT过表达的情况下，WT和S249A E***产生2-p-甘油的比较大速度（Vmax）都比T19A E***高得多（图1k）。随后研究T19糖基化是否会影响E***的低聚物化状态。Co-IP实验发现T19A E***破坏E***之间的结合；TMG处理则增强WT之间的互作，但没有增强T19A E***之间的互作（图1l）。另外，使用水溶性的交联剂BS3（可与蛋白质上的伯胺（-NH2）反应，以稳定E***的寡聚化状态）处理，发现O-糖基化增加了WT E***二聚体蛋白的数量，但对T19A突变体没有明显影响（图1m）。表明T19 O-糖基化通过促进E***活性二聚体的形成来促进E***活性。

图1 确定E***的O-糖基化修饰2个位点T19/S249，其中T19 O-糖基化影响其活性（Ref. Fig 2/S2）

（2）E***的S249 O-糖基化通过抑制STUB1和PD-L1的结合促进PD-L1的稳定性

据报道，E***可以通过结合PD-L1增强PD-L1与E3连接酶STUB1的关联，从而增加细胞中PD-L1的降解。

第一步，预测分析E***和PD-L1之间的互作

基于AlphaFold2预测分析发现位于与PD-L1相互作用界面的E***的四个关键残基（N52、K54、K197和E250）（图2a-b）。

第二步，E***的E250介导与PD-L1相互作用

对每个残基构建N52A、K54A、K197A和E250A突变体，Co-IP分析发现E250突变为丙氨酸（E250A）明显降低了E***与PD-L1之间的相互作用（图2c）。另外，分析还发现E***的E250能够与PD-L1上的R125形成临界盐桥，从而增强相互作用的稳定性（图2a）。表明E***的E250在介导PD-L1相互作用中的重要作用。

第三步，E***上E250附近S249糖基化影响其与PD-L1相互作用

构建全长E***及其各种截断突变体（N端区域、DNA结合域和C端区域），GST pulldown实验显示只有全长的E***和E***的C端区域（包含S249糖基化位点）显示出与PD-L1的结合信号（图2d）。提示靠近关键E250残基的S249上的大量糖基化修饰可能会破坏与PD-L1的相互作用。Co-IP分析发现，过表达WT E***明显减少PD-L1水平；而过表达S249A E***，且无论是否存在OGT过表达，PD-L1均无明显变化（图2e-f）。进一步探讨E*** O-糖基化对WT、T19A或S249A E***与内源性PD-L1相互作用的影响。Co-IP分析显示，过表达WT或T19A E***后，OGT过表达增加O-糖基化水平，但降低了E***与PD-L1互作，并伴有PD-L1蛋白水平的升高，而在过表达S249A E***的细胞中没有观察到这种作用（图2g-h）。类似的，TMG处理也增加了WT E***重组细胞中的PD-L1蛋白水平，但在S249A重组细胞中没有（图2i-j）。表明E***上E250附近S249糖基化抑制其与PD-L1互作，降低PD-L1的蛋白水平。

第四步，E*** S249 O-糖基化通过蛋白酶体降解途径抑制PD-L1的表达

Qpcr检测发现OGT的过表达并未改变PD-L1 mRNA水平，表明PD-L1的调控机制与转录无关（图2k）。分析PD-L1的半衰期，发现TMG可促进WT E***过表达细胞中PD-L1的稳定性，但对S249A E***过表达细胞无促进作用。此外，蛋白酶体抑制剂MG132，而不是溶酶体抑制剂氯喹（CQ）或自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），挽救了S249A E***过表达细胞中PD-L1的降解（图2l），表明E*** S249 O-糖基化通过蛋白酶体降解途径抑制PD-L1的表达。

图2 E***上E250附近S249糖基化影响其与PD-L1相互作用（Ref. Fig 4/S4/S5）

第五步，E***促进PD-L1与STUB1的结合

据报道，E***通过募集E3连接酶STUB1调节PD-L1的蛋白酶体降解。敲减STUB1，PD-L1表达增加（图3a）。IP-WB实验发现PD-L1泛素化降低，证实STUB1是CRC细胞中PD-L1的E3连接酶（图3a）。此外，E***的缺失增加了PD-L1水平，IP-WB显示PD-L1泛素化降低，重新表达WT E***逆转了这种效应（图3b-c）。相反，过表达E***可抑制PD-L1的表达，敲减STUB1，则抑制作用被消除（图3d）。另外，内源性Co-IP实验发现E***的缺失抑制PD-L1与STUB1互作（图3e），而E***过表达则以剂量依赖性的方式增强PD-L1与STUB1互作（图3f）。GST pulldown实验也证实该结果（图3g）。表明E***促进了PD-L1与STUB1的结合。

第六步，E***糖基化通过减少PD-L1与STUB1的结合来抑制PD-L1的蛋白酶体降解

推测E***糖基化通过减少PD-L1与STUB1的结合来抑制PD-L1的蛋白酶体降解（图3h）。为了验证这一点，Co-IP分析发现，在WT E***过表达细胞中，TMG处理后，降低PD-L1泛素化及其与STUB1的互作，但在S249A E***过表达细胞中没有降低（图3i）。此外，WB检测显示，过表达OGT可增强WT E***过表达细胞中PD-L1的表达，而在S249A E***过表达细胞中则无此作用。而敲减STUB1抵消这种增加（图3j）。

表明E***糖基化阻断了其与PD-L1的相互作用，减少了STUB1与PD-L1的相互作用，从而抑制了STUB1介导的泛素化和PD-L1的蛋白酶体降解。

图3 E***糖基化通过减少PD-L1与STUB1的结合来抑制PD-L1的蛋白酶体降解（Ref. Fig 4/S6/S7）

结论：研究人员发现E***的表达水平在结肠AI组织中明显上调。功能上，E***促进肿LIU生长。机制上，质谱分析和实验验证提示苏氨酸19位（T19）以及丝氨酸249位(S249)是E***上主要的糖基化修饰位点。一方面，T19的糖基化通过促进活性二聚体的形成提高了其酶活性，促进肿LIU生长；另一方面，研究团队发现S249的糖基化抑制了E***与PD-L1的互作，并阻断了STUB1介导的PD-L1泛素化以及蛋白酶体降解，促进了 PD-L1蛋白表达，进而JI活 PD-1/ PD-L1 介导的肿LIU免疫逃逸。此外，抑制E***两个位点的糖基化能联合PD-L1单抗协同抑制结直肠肿LIU生长。提示E***的糖基化在结直肠AI临床免疫治L和检测中具有重要的意义。