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湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装

来源: 发布时间:2023年02月15日

自噬可通过调控免疫来发挥抗瘤作用。多种人类实体瘤细胞中都存在自噬活性的改变,且研究表明自噬与瘤免疫应答具有很大的相关性。在瘤固有的免疫中,自噬可参与瘤相关巨噬细胞分化,进而影响瘤的新生血管生成、免疫抑制和侵袭转移,当自噬受抑制时,巨噬细胞向M2型分化,促进瘤血管生成;反之巨噬细胞向M1型分化,抑制瘤的进展。在瘤的特异性免疫中,自噬在T淋巴细胞存活、发育、稳态及功能调节中发挥重要作用,有研究表明自噬缺陷的T淋巴细胞内线粒体数量异常增加,ROS增加,所以自噬可能通过细胞稳态影响T淋巴细胞发挥功能;还有研究表明自噬缺陷的B祖细胞不能发育成为前体B淋巴细胞;自噬还可参与抗原递呈过程,一方面自噬形成的降解产物可以被递呈到主要组织相容性复合物Ⅰ或Ⅱ类分子表面增强特异性免疫应答,另一方面,瘤自噬小体可作为树突状细胞(DC)的交叉递呈抗原,更有效地提升CD8+T淋巴细胞应答能力。自噬与凋亡合作方式在现有研究报道中较为多见。湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装

磷酸甘油变位酶家族蛋白5(phosphoglyceratemutasefamilymember5,PGAM5)激huo可使Ser13去磷酸化,促进其与LC3的作用。有研究表明,PGAM5的作用受Bcl-2L1/Bcl-xL调控。生理条件下Bcl-2L1/Bcl-xL通过BH3结构域抑制PGAM5的激酶活性,提高Ser13在FUNDC1上的磷酸化水平,从而抑制线粒体自噬。低氧时,Bcl-2L1降解,释放PGAM5,PGAM5去磷酸化Ser13,激huo线粒体自噬。Tyr18、Ser13、Ser17联合调节FUNDC1介导的线粒体自噬途径。有研究证实,miR-137也可以通过抑制FUNDC1的表达而负性调节该通路。另有相关报道,PGAM5-FUNDC1可能与PINK1-Parkin途径有相互作用,且PGAM5和FUNDC1的缺失可抑制Parkin介导的线粒体自噬。湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装由于自噬体膜形成过程中需要LC3,因此通过标记LC3可以识别自噬体。

自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡,并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物的过程,借此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到,其所起的作用是正面还是负面的尚未完全阐明,值得关注。自噬是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体(autophagosome),并与溶酶体融合形成自噬溶酶体,降解其所包裹的内容物,以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。

在用GFP-LC3B慢病毒ganran细胞后,在非自噬的情况下,荧光显微镜下GFP-LC3B以弥散的形式存在于细胞质中;而在自噬的情况下,荧光显微镜下GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上,以斑点的形式表现出来(LC3B dots or punctae)。RFP-GFP-LC3B是研载生物研发的重组慢病毒,ganran后能够在靶细胞中有效表达红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白,呈现明亮的红色和绿色荧光,可以用于细胞自噬的检测。自噬小体在与溶酶体融合过程中,溶酶体内的酸性环境会导致GFP荧光淬灭,这为追踪GFP-LC3B的细胞定位增加了难度。在自噬的情况下,荧光显微镜下RFP-GFP-LC3B则聚集在自噬体膜上,以黄色斑点的形式表现出来。

自噬发生过程:在此过程中,自噬体的形成是关键,其直径一般为300~900nm,平均500nm,囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等。与其他细胞器相比,自噬体的半衰期比较短,只有8min左右,说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。在整个自体吞噬过程中,细胞质和细胞器都受到破坏,较明显的是线粒体和内质网受损。虽然自体吞噬并不直接破坏细胞膜和细胞核,但是有证据表明,在较初断裂或消化后,细胞膜和细胞核会较终变成溶酶体以消化和分解自身。溶酶体是自噬完成的关键场所。湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装

吴茱萸碱可能通过诱导Ca2+内流,激huoJNK通路诱导自噬。湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装

目前使用较多的自噬流检测方法是通过Western blot 检测 microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3B (LC3B) 蛋白表达水平,但是如果没有自噬工具药作为对照,则观察到的 LC3B 改变无法真实反映细胞内自噬流状态。例如 LC3B-II 增加既可能是自噬活化后自噬小体增多而成,也可能是自噬溶酶体qingchu失败所致。自噬流的检测方法较为复杂,单独使用现有的某一种技术方法往往不能达到系统性检测自噬流,因此需要选择多种不同实验方法,综合评价其检测结果才能较为客观地反映细胞自噬流状态。湖北mRFP-GFP-LC3双荧光自噬慢病毒包装

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