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厦门实时定量PCR应用

来源: 发布时间:2023年07月23日

Real-time PCR双荧光标记探针设计原则:具体的其他要求可以具体联系设计公司,拿到合成好的引物,需要先确认引物的性能。可以用这对引物先扩增梯度稀释后的标准品(标准品介绍见后续内容)。由不同梯度标准品的加量和其对应的Ct值,描绘出一条标准曲线。这里要注意根据标准曲线得到的参数是非常重要的。引物性能确认:1.决定系数R2大于0.98,越接近于1,结果越可靠。2.扩增效率一般要求在0.8-1.2,越接近于1,越好。3.检测的灵敏度,必须确认,通常要求35个循环以内,一般可以得到比较好的定量结果,30个循环以内,没有非特异性扩增产生。4.NTC是必须要确认的,通常要求30个循环内没有引物二聚体产生。所谓实时荧光定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团。厦门实时定量PCR应用

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聚合酶链式反应:因为PCR扩增了目的DNA区域,所以PCR可以用于分析极少量的样品。这对于法医检定法,当时只有微量的DNA可作为证据。聚合酶链反应也可用于分析古代DNA那已经有数万年的历史了。这些基于聚合酶链反应的技术已经成功地应用于动物身上,例如四万年前猛犸,以及人类DNA,定量聚合酶链反应或者实时聚合酶链反应不要与逆转录-聚合酶链反应方法混淆)允许估计样品中存在的给定序列的量——这种技术通常用于定量确定基因表达的水平。定量PCR是一种已建立的DNA定量工具,用于测量每轮PCR扩增后DNA产物的积累。聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。厦门实时定量PCR应用聚合酶链反应的这种能力增强了许多方法,例如生成杂交探针用于杂交。

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Real-time PCR操作流程:1、收集样品。2相关试剂总RNA提取试剂TREzolReagent(RNA提取试剂),M-MLV(cDNA逆转录酶),RNA纯化试剂,RealqPCRMasterMix(萤光定量PCR预混试剂)。3实验仪器萤光定量PCR仪;PCR仪;低温离心机。4总RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl随机引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA5分钟,冰上速冷1分钟,离心将溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer;1µlRNaseout;1µlM-MLVRT;加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设定37℃延伸60min,70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于-20℃保存备用。

Real-time PCR实验常用的RNA酶抑制剂:1.焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。2.异硫氰酸胍:目前被认为是较有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。3.氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。5.其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物,内标用基因工程方法合成。

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Real-time PCR的染料法和探针法的选择:进行mRNA表达量的测定,采用染料法是比较经济实惠的;染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况;目的基因和内参基因分管检测,染料法可以选用Realtime染料PCRPreMIX,探针法主要应用于病毒RNA的检测;以及单位点突变(SNP);多基因的合并检测,探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况;而染料法则必须分管检测。Real-time PCR:实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称Real-time PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,之后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。Real-time PCR技术即实时萤光定量PCR避免了传统PCR以终产物监测定量产生的偏差。宁波细胞荧光定量PCR供应商

Real-time PCR探针法普遍用于人类传染病的诊断和病原定量。厦门实时定量PCR应用

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