宁波微量数字PCR应用

所谓real-timeQ-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，之后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在real-time技术的发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的运用。Real-time PCR反应的一个主要限制是，为了产生其选择性扩增的引物，需要目标序列的先前信息。宁波微量数字PCR应用

Real-time PCR：使用Real-time PCR进行基因检测,被普遍应用于病毒和病原菌检测、转基因食品检测、遗传病基因检测等领域。一般首先需要利用专业使用的试剂盒从待检样品中提取其核酸（DNAorRNA），并经过精制等复杂的操作（通常称为前处理操作）之后才可以进行Real-time PCR。不易受反应阻害物的影响，使用时不需要进行复杂的前处理操作，单单需将待检样品直接加入到检测试剂中即可开始检测。通过使用本产品，可以在更短的时间内，简便、低成本地进行Real-time PCR检测。莆田特殊样本数字PCR原理及步骤Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的检测。

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。武汉微量Real-time PCR供应商聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反应体系中加入荧光物质，然后通过荧光化学物质监测每次PCR反应循环后产物总量的方法，之后通过内参法或外参法对待测样品中的特定DNA序列（目的基因）进行定量分析的方法。实验过程中，这些荧光物质可以在激发光的作用下释放出一定波长的发射光，定量用PCR仪通过对这些发射光进行实时监测，较终可以描绘出整个PCR的反应过程，这就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR链式反应：DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DNA聚合酶在高温时会失活。Real-time PCR在实验过程中要防止RNA的降解。

Real-time PCR探针法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。莆田特殊样本数字PCR原理及步骤

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