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Real-time PCR萤光染料掺入法:在PCR反应体系中，加入过量SYBR萤光染料，SYBR萤光染料特异性地掺入DNA双链后，发射萤光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何萤光信号，从而保证萤光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。此方法适用于：1、灵敏度高：使用SYBR可使萤光效果增强到1000倍以上。2、通用性好,不需要设计探针,方法简便,省时,价格低廉。3、通用型方法，在国内外科研中普遍使用。4、高通量大规模的定量PCR检测。5、专一性要求不高的定量PCR检测。序列间特异性聚合酶链反应放大简单重复序列之间的区域，以产生扩增片段长度的独特指纹。厦门微量数字PCR供应商

Real-time PCR链反应：嵌套聚合酶链反应:通过减少DNA非特异性扩增的背景，提高DNA扩增的特异性。两组引物用于两个连续的PCR。在个反应中，一对引物用于产生DNA产物，除了预期的靶之外，该产物可能仍然由非特异性扩增的DN段组成。然后用一组引物将产物用于第二次聚合酶链反应，所述引物的结合位点完全或部分不同于次反应中使用的每个引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特异性扩增长DN段方面通常比传统PCR更成功，但它需要更详细的目标序列知识。重叠延伸聚合酶链反应或者通过重叠延伸拼接(SOEing):一种用于将两个或多个含有互补序列的DN段拼接在一起的基因工程技术。它用于连接含有基因、调节序列或突变的DN段；这项技术可以创造特定的长DNA构建体。它还可以将缺失、插入或点突变引入DNA序列。武汉实时数字PCRPCR反应的很大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性。

Real-time PCR相对定量中的标准曲线法如何进行：主要是相对定量标准品的制作，一般有三种方法：1、比较复杂的方法：质粒，采用Biotnt提供内参基因的特异性Real-time PCRmRNA引物，对目的基因进行Real-time PCR实验，得到PCR扩增产物；PCR扩增产物转入质粒中，得到相对定量的标准品；2、一般采用的方法1：比较强的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR扩增产物，如果在方法2中找不到比较强的CDNA模板，则选用PCR产物作为相对定量的标准品也是可以的；需要注意的事项是：PCR产物浓度很高，而Real-time PCR的产物片段比较短，容易在稀释的过程中造成PCR污染，要注意操作。

Real-timePCR的反应条件：dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度。Real-time PCR探针法实验结果稳定重複性好，特异性更高。

聚合酶链式反应的试验污染：阳性对照，在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。因而当某一PCR试剂经自己使用稳定。聚合酶链式反应可看作是生物体外的特殊DNA复制。武汉实时数字PCR

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团。厦门微量数字PCR供应商

Real-time PCR链式反应的特点：灵敏度高：PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=-6）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位）；在细菌学中很小检出率为3个细菌。简便、快速：PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。纯度要求低：不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。武汉微量Real-time PCR供应商聚合酶链反应的试剂应分配到一次性的等分试样中。厦门微量数字PCR供应商

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