厦门血液Real-time PCR服务

Real-time PCR探针法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的时间内复制完成。厦门血液Real-time PCR服务

Real-time PCR反应：多重连接依赖探针扩增（MLPA):允许用单个引物对扩增多个靶标，从而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶链反应:由单个PCR混合物中的多个引物组组成，以产生对不同DNA序列特异的不同大小的扩增子。通过同时靶向多个基因，可以从单次测试中获得额外的信息，否则将需要几次试剂和更多时间来执行。每个引物组的退火温度必须优化，以在单个反应中正确工作，并符合扩增子尺寸。也就是说，当通过凝胶电泳可视化时，它们的碱基对长度应该足够不同以形成不同的条带。宁波骨头定量PCR技术服务Real-time PCR在实验过程中为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。

Real-timePCR的反应条件：dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度。

内标在传统定量中的作用，由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。内标对定量PCR的影响，若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为明显。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。电子PCR被提出作为分子生物学的教育工具。

PCR的反应条件：dNTP浓度过高会加快反应速度，但同时还可以增加碱基的错误掺入率。引物浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增。TaqDNA聚合酶浓度过高会引起错配和非特异性产物扩增，低则合成产物量减少。TaqDNA聚合酶无校正功能，掺入错误率达2*E-4个核苷酸，一个30个循环的扩增反应0.1%-0.25%总错误率。在90～95度下可使整个基因组的DNA变性为单链。一般94～95度30～60s。时间过长使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破坏增多。DNA很快冷却到40～60度使引物和模板结合。引物长度在15～25时退火温度。热启动/冷完成聚合酶链反应是通过新的杂合聚合酶实现的，这些酶在环境温度下不活跃。PCR的很大特点是能将微量的DNA大幅增加。南通骨头荧光PCR哪家好

逆转录聚合酶链反应(逆转录-聚合酶链反应)：用于从RNA中扩增DNA。厦门血液Real-time PCR服务

Real-time PCR原理：基于探针的化学法，Real-time PCR应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物，单单检测特异性扩增产物，DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR，探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性；探针可标记不同波长的荧光基团，用于多重PCR反应。对于不同的靶序列需要合成不同的探针，原料成本较高。厦门血液Real-time PCR服务

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