宁波珠海鼠尾胶原

鼠尾胶原胶凝程序：胶原蛋白I按以下步骤使其pH达到碱性时凝胶。1）将无菌5cm左右的纱布海绵贴在150mm培养皿的盖子上来制备氨蒸气室。用氢氧化铵使纱布饱和，把盖子放在150mm的培养皿上，暂放置一边。2）将胶原蛋白I均匀涂布在要包被物的表面上，厚度可以根据需要改变，胶原蛋白I（50-100μL）足以涂覆22mm的盖玻片。对于直径100mm的培养皿，每个加入约6mL;对于60mm培养皿添加约2.3mL，对于35mm培养皿添加约1mL。3）将涂有胶原蛋白的盖玻片或带有盖子的培养皿转移到氨蒸气室并暴露三分钟。4）在无菌蒸馏水中（35mm培养皿加5mL，60mm培养皿加10mL等）浸泡涂布的盖玻片或培养皿30min。吸取原蒸馏水并加0.5-1.0mL无菌蒸馏水，放置在层流罩中过夜。5）吸出蒸馏水，用含血清的平衡盐缓冲液溶液代替并保存在2-8°C。鼠尾胶原醋酸溶解：在室温或37度结合数小时或者2-8度过夜。宁波珠海鼠尾胶原

胶原蛋白的提取方法：1.碱法提取：碱法提取胶原蛋白常用的处理剂为石灰、氢氧化钠、碳酸钠等。如Holzer等[5]采用1%～1.5%石灰水浸泡的方法提取胶原蛋白。由于它容易造成肽键水解，因此得到的水解产物分子量比较低。所以，若想保留胶原的三股螺旋结构，此法不可取。2.盐法提取：盐法提取胶原蛋白所用的中性盐有盐酸-三羟甲基胺基甲烷(Tris-HCl)、氯化钠、柠檬酸盐等。在中性条件下，当盐的浓度达到一定量时，胶原溶解。并且可采用不同浓度的氯化钠对提取的胶原蛋白进行盐析处理，可以沉淀出不同类型的胶原蛋白。正规鼠尾胶原厂家推荐鼠尾胶原，是一种天然培养基，它具有促进体外培养细胞(特别是上皮细胞)贴壁的作用。

详细步骤如下：1.75％酒精浸泡大鼠尾巴30min；2.将尾巴剪开、去掉皮毛，并剪成小段（3cm左右），抽出银色的尾键；3.把剪碎的尾键置于150ml，0.1％消过毒的醋酸中，4℃放置，并不时振荡；4.48h后取上清，4000转离心30min后，取上清；5.分装上清（鼠尾胶）4度（或-20度）保存。有时可继续向4。中沉淀中加入10－20ml醋酸，重复以上步骤，以制备更多的鼠尾胶。在使用时，先将冰存的胶原液在室温下解冻，再按以下步骤包被培养器皿：1）用吸管吸取胶原液，在无菌的培养器皿的生长面内壁上均匀地涂上薄薄的一层胶原溶液。2）若包被的是培养瓶，可向培养瓶通入氨气或用浸有氨水的棉球封口片刻。让氨气充入瓶内后，即可旋紧瓶盖或塞紧瓶塞。若为培养皿或板的话，可将培养皿或板放在已消毒的饭盒内，将浸有氨水的棉球放入饭盒内，盖紧饭盒盖，四周用封口胶封死。

生物医用鼠尾胶原蛋白的提取方法，采用酸法与酶法相结合的工艺，保持恒低温无菌的环境，利用同样浓度的盐溶液进行两次盐析与离心，简化了提纯步骤。所用酸为低浓度酸溶液，并采用柠檬酸替代醋酸进行提纯。从提取原料到样品生成过程中，进行多次真空冷冻干燥，并经进一步处理获得含水率在3％以下的胶原蛋白微粉；较后由灭菌、无菌包装，成品胶原蛋白粉末的纯度在98％以上。本发明获得的胶原蛋白降低了蛋白的免疫原性，提高了产率和生物相容性，降低了成本，适用于生物医用材料，所得到的胶原蛋白能完整地保留其特有的三股螺旋结构。布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录。

鼠尾胶原蛋白I型在浓度1mg/ml以上，pH7左右时可形成具有一定强度三维胶,建议成胶浓度1-2mg/ml。胶原蛋白溶解于0.006mol/L乙酸中，在成胶过程中需要加入0.06X体积的0.1mol/LNaOH来中和。需要的溶液(均需要无菌、预冷):10xPBS(可含10mg/L的酚红用于pH指示)或10x培养液,0.1mol/LNaOH,0.1mol/L乙酸(一般不用),双蒸水不含细胞的三维胶原的制备（以配制1毫升，1mg/ml三维胶为例）：将200ul生友鼠尾胶原蛋白I型(5mg/ml)加到置于冰浴的离心管中，加入690ulH2O。然后加到12ul0.1mol/LNaOH中（如果反过来把12ul0.1mol/LNaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结），立即混匀。再加入100ul10xPBS或10x培养液，混匀后立即加到培养器皿中(混匀后pH为7左右，如果PBS或培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试)。制备鼠尾胶原：重复步骤2、3，直至尾腱量够用。成都正规鼠尾胶原单价

鼠尾胶原醋酸溶解：稀释一定数量的胶原溶液。宁波珠海鼠尾胶原

实验应用：探讨应用鼠尾胶原在豚鼠前庭毛细胞膜片钳实验中的促进毛细胞贴壁效果。方法制作鼠尾胶原，观察全细胞膜片钳实验中，自制的鼠尾胶原对前庭毛细胞的贴壁黏附作用。结果无鼠尾胶原时，前庭毛细胞悬浮于外液，不宜封接；有鼠尾胶原时，前庭毛细胞贴附于培养皿底壁，易于封接和长时间(约8h)的观察和记录。鼠尾胶原对前庭毛细胞具有良好的贴壁黏附促进作用。结论鼠尾胶原能促进毛细胞贴壁，涂布鼠尾胶原有利于膜片钳实验的长时程记录，并且制作简便，成本低廉。宁波珠海鼠尾胶原