干货：外泌体研究实操中的常见问题解答

Umibio 产品：UR52121 /UR52120 外泌体提取纯化试剂盒（细胞上清）

Q：如何增加外泌体试剂盒的提取效率？

A：首先，样品准备阶段确保样品的质量和数量充足；在提取阶段，加入ECS试剂后可以通过增加静置时间来提高提取效率，但同时也可能影响到纯度，因此静置时间也需要适当控制，初次实验可以考虑静置过夜。

Q：离心后无法看到沉淀如何处理？

A：样品中的外泌体是微量的存在，离心后无法看到沉淀属于正常现象。建议离心后用PBS重悬沉淀时不仅洗脱肉眼可见的沉淀部位，还要吹洗离心管外侧靠近底部的狭长区域，具体位置根据离心机倾斜角度决定。建议在下次样品准备阶段确保样品的质量和数量充足，干细胞/原代细胞上清可在提取前采用超滤管（100KD）浓缩3~5倍后再提取。

Q：使用EPF柱时堵塞如何处理？

A：过滤柱的孔径在220nm左右。如果出现堵塞情况，可以将柱子旋转180度再次离心。若上室还有残留液体，需要使用新的EPF柱，该柱子可以单独购买（产品货号UR90102）。

Q：沉淀法的具体原理是什么？

A：将高亲水性聚合物（聚乙二醇等）添加到含外泌体的溶液中后，外泌体周围的水分子被聚合物束缚，降低了外泌体的溶解度并诱导其随后的沉淀，使外泌体在低速离心下可以很容易沉淀。

Q：开封后的ECS试剂有沉淀出现是否可以继续使用？

A：沉淀物如果是结晶状，建议56度水浴摇晃混匀。如果结晶消失，则可以继续使用，少量沉淀不影响提取效果。

Umibio 产品：UR52146/UR52149外泌体提取试剂盒（乳液）

Q：乳液提取试剂盒加solution B之后无豆花状固体，此时是否可以继续实验？

A：不可以，必须在明确看到豆花状沉淀，溶液变透明后才可进行下一步操作。此时需要继续加入适量solution B，并在37度水浴加热，直至看到豆花状沉淀。

Umibio 产品：UR52151/UR52150外泌体提取纯化试剂盒（血液）升级版

Q：试剂盒UR52151与UR52136有哪些不同？

A：试剂盒UR52151相较UR52136增加了去杂蛋白环节，提升了外泌体的纯度，相应得率会有所下降。血清样品蛋白含量很高，沉淀法试剂盒无法实现完全分离（两款均是），不建议做外泌体阴性蛋白（如calnexin）检测。

Q：如何选择血清和血浆样本来进行外泌体研究？

A：血清和血浆都是常见的外泌体样本来源。由于血液在凝血过程中血小板会受到刺激会产生大量外泌体，因此若需要排除血小板外泌体的影响应采用血浆进行外泌体提取检测。

Q：出现溶血现象的血清/血浆样本对外泌体提取有什么影响？

A：破碎的细胞会释放一些杂质影响下游实验，尤其是电镜鉴定。溶血样品里的外泌体也会降解。溶血样品不建议用于外泌体提取。

Q：试剂盒可以提取多少血清/血浆样本的外泌体？

A：该试剂盒一共可以提取20个样本的外泌体，每个样本最大体积为1mL。建议使用0.5mL体系进行实验，在EPF柱纯化外泌体阶段再进行样本合并。

Umibio 产品：UR52161/UR52160外泌体提取纯化试剂盒（组织）

Q：组织提取试剂盒如何提高得率？

A：加入solutionA2后可以增加消化时间，不超过1小时；加入solutionB2后可以增加静置时间，不超过1小时。

Umibio 产品：UR52301 外泌体 CD63&TSG101蛋白检测试剂盒

Q：Western Blot报告中PC条带是何种蛋白？

A：PC是系统样品，用于指示本次Western Blot检测系统是否正常工作。如果PC有条带，目的样品无条带，说明目的样品的目的蛋白丰度很低；如果PC也无条带，则说明本次实验体系存在问题。

Q：外泌体蛋白质标记物为何会有两条条带？

A：在不同的样品中检测到的蛋白条带大小和带数存在差异是正常现象。膜蛋白由于修饰剪切等缘故，可能会出现多条带的状况；不同细胞中修饰剪切等情况不一定相同，因此相同蛋白在不同样品中检出的条带表现可能不同属于正常情况。

Q：CD63是一个多次跨膜蛋白，煮样可能导致蛋白聚集，应该如何判断是否煮样？

A：建议CD63进行煮样，温度控制在70度，时间为10min。

Umibio 产品：UR52302/UR52303 外泌体红色荧光标记染料（PKH26/PKH67）

1、建议用于染料标记的外泌体原始浓度达到0.5~1μg/μL。外泌体浓度过低实验失败风险较高。

2、外泌体染色步骤中去除游离染料的第4、5步必不可少，以避免游离染料对后期实验的干扰。这一步相当于重新提取外泌体，所有外泌体提取纯化方式都适用。

3、去除游离染料的方法推荐选择3~10KD的超滤管，利用其置换溶剂功能去除游离染料。具体步骤和实验参数请咨询超滤管厂商。

4、染料标记外泌体与细胞共孵育的培养条件尽可能使用无血清培养基，以提高细胞对染料标记外泌体的摄取效率，共孵育参考时长为2小时。

5、本染料也可用于细胞膜染色，参考剂量染料浓度为2X10–6 M，细胞浓度为1X107 cells/mL。

6、基于以下两个原因，建议准备2倍于正常共孵育实验所需外泌体的量来进行染料标记。一是使用过量染料进行标记，外泌体的染色效率仍无法达到100%；二是去除游离染料的过程中存在外泌体回收率的损失。

Umibio 产品：UR21017 外泌体荧光染料（DIR）

1、活体成像对外泌体浓度要求较高，建议用于染料标记的外泌体原始浓度达到0.5~1.5μg/μL，外泌体浓度过低实验失败风险较高。

2、外泌体染色步骤中去除游离染料的第4、5步必不可少，以避免游离染料对后期实验的干扰。这一步相当于重新提取外泌体，所有外泌体提取纯化方式都适用。

3、去除游离染料的方法推荐选择3~10KD的超滤管，利用其置换溶剂功能去除游离染料。具体步骤和实验参数请咨询超滤管厂商。

4、DiR碘化物（DiR染料）的发射波长肉眼不可见，需要使用配备CCD镜头或其他设备的近红外检测仪器，建议使用活体成像仪。

5、建议染料标记的外泌体在注射后24h内设置梯度时间进行观测，多数情况注射后2-8小时荧光强度达到峰值。为保证观察结果，小动物需要做剃毛处理。

6、基于以下两个原因，建议准备2倍于正常活体成像和示踪实验所需外泌体的量来进行染料标记。一是使用过量染料进行标记，外泌体的染色效率仍无法达到100%；二是去除游离染料的过程中存在外泌体回收率的损失。

Umibio 产品：UR32061 miRNA 加尾法逆转录试剂盒

Q：外泌体miRNA qPCR实验选用哪个基因做内参？

A：外泌体qPCR目前没有公认内参基因，本公司检测miRNA做的是外参。外参可以最大限度降低对定量实验造成的干扰，适用于内参表达不稳定的外泌体或暂未发现合适内参的其他样品，对目的microRNA进行相对定量，替代内参作用。部分文献也会选取U6等作为内参，可以参考对应文章。

Umibio产品：UR32071/UR32070 /UR32081/UR32080 2×SYBR Green qPCR 试剂（预混 ROX1型&预混 ROX2 型）

Q：下游qPCR检测时CT值过高如何处理？

A：外泌体RNA是微量的存在，首先样品准备阶段确保样品的质量和数量充足（例如血清建议新鲜样本准备2ml以上）。有实验表明，2ml血清样本提取的外泌体，qPCR检测U6（细胞样本microRNA内参）的CT值只有30+，目标基因CT值在30+~40+。CT值通常qPCR结果在30以上默认为不表达，但外泌体比较特殊，可适当放宽标准。

Q：外泌体qPCR实验如何使用内参？

A：外泌体没有公认内参，常规内参基因在外泌体中表达量甚至可能比目标基因还低。外参是在没有合适内参的情况下的替代物。microRNA 检测外参是化学合成的线虫短片段单链 RNA (cel-miR-39-3p) mimics，经检测在人类、小鼠、大鼠中均无同源片段，最大限度降低了对定量实验造成的干扰，适用于内参表达不稳定的外泌体或暂未发现合适内参的其他样品，对目的 microRNA 进行相对定量。

外参序列：ucaccggguguaaaucagcuug；

cel-miR-39-3p 外参正序列：AACACGCTCACCGGGTGTAA。

Q：国产仪器应该选择哪款qPCR试剂盒？

A：多数国产仪器可以不用ROX校准，所以推荐用低浓度的ROX2试剂盒。具体型号可以咨询我司。

Umibio 产品：UR21021 外泌体 GW4869抑制剂

Q：M指的是什么单位？

A：M指的是体积摩尔浓度，mol/L。

Q：GW4869的溶剂是什么？

A：DMSO。

Umibio 产品：UR51102/ UR51101 外泌体专用培养基

Q：外泌体专用培养基是否可用于重悬、接种以及继续培养细胞？

A：不可以。外泌体专用培养基不含促细胞贴壁的因子，可以维持已贴壁的细胞一定时间内的生长，无法替代完全培养基长期培养细胞。

Q：外泌体专用培养基有哪些成分？

A：产品含有 HEPES，L-Glutamine, Pharm Grade Albumin, Hypoxanthine, Thymidine, Phenol Red, Glucose（偏低糖2g/L）. 无动物源Xeno-free, Serum-free.不含生长因子（Growth factors），细胞培养过程中无需添加血清即可达到完全培养基的培养状态。

Umibio 产品：UR51121/UR51120 外泌体专用间充质干细胞培养基

Q：干细胞在更换外泌体专用间充质干细胞培养基的过程中，遇到干细胞生长缓慢，甚至死亡的现象，该如何处理？

A：干细胞在更换培养基的过程中，对于培养环境比较敏感，尤其是从高营养环境（血清/HPL添加培养基）更换到低营养环境（化学成分确定培养基）的过程中会遇到干细胞生长缓慢，甚至死亡的现象，这些都是更换培养体系过程中经常遇到的问题。

解决方案1：提高更换培养基时干细胞的融合度。细胞融合度从说明书中20%提高到50%-60%时，然后更换外泌体专用间充质干细胞培养基，然后在细胞融合度70%-80%以上时收集细胞上清液。

解决方案2：采用的是培养基逐步替换的方法。逐步减少原干细胞培养基的用量和逐步增加外泌体专用间充质干细胞培养基的用量，在干细胞融合度20%时，吸取一半的原始培养基，加入一半的外泌体专用间充质干细胞培养基，细胞培养24小时后，再替换为完全的外泌体专用间充质干细胞培养基的进行培养。

Umibio 产品：UR52031/UR51032/UR51039LipoP30转染试剂

Q：lipo30进行siRNA的转染步骤有无特殊要求？

A：在共转染混合物中添增强剂是为了促进质粒DNA的转染，它对siRNA的转染没有效果，因此在单独进行siRNA转染时无需在转染混合物中添加（即第2步在稀释 siRNA 时不要加入LipoP30-A试剂）。

Q：lipo30进行不同种类核酸转染时有何不同要求？

A：对于未经修饰的siRNA、Silencer siRNA、Stealth RNAi siRNA、Silencer Select siRNA、Ambion Pre-miR前体、mirVana miRNA 模拟物、Ambion Anti-miR 抑制剂与mirVana miRNA抑制剂而言，只需使用B试剂即可有效递送至胞浆。此时无需使用A试剂。

对于质粒DNA、基于载体的BLOCK-iT shRNA或miRNA、ViraPower HiPerform慢病毒表达载体，或GeneArt CRISPR核酸酶载体而言，B试剂需与A试剂联用以确保高效的细胞核递送效果。