CircNOLC1结合蛋白质和miRNA调控结直肠AI转移

正文

结直肠AI患者常因转移而死亡，肝脏是转移的主要部位。然而，只有少数患者可接受手术切除，导致5年生存率极低。因此，迫切需要深入研究结直肠AI转移中的基因变化和调控机制，以发现新的诊疗靶点，开发更有效的抗AI疗法，提高患者的生存率和生活质量。

2023年11月，大连医科大学任双义、左云飞团队在Advanced Science（IF=15.1）上发表“CircNOLC1 Promotes Colorectal Cancer Liver Metastasis by Interacting with AZGP1 and Sponging miR-212-5p to Regulate Reprogramming of the Oxidative Pentose Phosphate Pathway”的研究文章。体内、外实验显示CircNOLC1促进结直肠癌细胞增殖、迁移和肝转移。机制研究表明circNOLC1与AZGP1相互作用以及circNOLC1/miR‐212‐5p/c‐Met轴在氧化磷酸戊糖通路介导的结直肠AI转移中发挥关键作用，可能为结直肠AI的个体化医疗提供新的靶点。

图形摘要如下：

Highlights如下：

1）circNOLC1在转移性CRC中高表达。敲减circNOLC1抑制CRC细胞的生长和肝转移。

2）circNOLC1调节G6PD水平和活性，以mTOR依赖的方式促进戊糖磷酸途径。

3）机制上，通过ChIRP-MS和RIP实验，发现circNOLC1与AZGP1互作，活化mTOR/SREBP1信号通路，此外，anti-AGO2 IP实验还发现circNOLC1吸附miR‐212‐5p上调c‐Met表达，二者均可诱导G6PD活化氧化磷酸戊糖通路在结直肠AI肝转移中发挥作用。另外，ChIP实验证实YY1可调控circNOLC1表达。

circNOLC1在转移性CRC中表达水平高于非转移CRC，在CRC表达水平高于正常组织。

功能研究：

circNOLC1敲减抑制结直肠癌细胞的增殖和转移，动物模型结果显示，circNOLC1敲减抑制PDO生长，裸鼠肝脏转移，提高生存率。过表达circNOLC1则结果相反。

机制研究：

据报道circNOLC1亲本基因NOLC1与代谢有关，为了探索circNOLC1机制，进行转录组学和代谢组学，综合富集分析表明，circNOLC1敲低导致氧化磷酸戊糖途径(oxPPP)代谢通路、代谢物、关键基因发生变化（图1a-c）。G6PD是oxPPP的限速酶，细胞和动物实验结果表明，circNOLC1增强mTOR、G6PD活性，oxPPP重编程和CRC细胞的肝转移潜能（图1d-e）。

图1 circNOLC1调节G6PD水平和活性，以mTOR依赖的方式促进戊糖磷酸途径（Ref. Fig3）

研究表明，circrna可与蛋白质相互作用形成circRNPs，影响相关蛋白质的功能。为了探索circNOLC1诱导oxPPP代谢的分子机制，鉴定潜在的circNOLC1互作蛋白，结合ChIRP-MS和RNA pulldown-WB实验，发现AZGP1, DSG1和KRT16证明与circNOLC1存在互作（图2a-c）。因AZGP1在CRC中高表达，且在葡萄糖代谢中发挥重要作用，故将其作为研究对象。RIP实验发现circNOLC1在anti-AZGP1下拉物中富集（图2d）。为了确定circNOLC1与AZGP1互作区域，设计circNOLC1缺失突变体，进行RNA pulldown实验，表明circNOLC1的nt 91-150是circNOLC1与AZGP1相互作用必需的（图2e）。

进一步检测发现，circNOLC1调控AZGP1蛋白水平，用蛋白酶体抑制剂处理细胞显示MG132显著提高AZGP1蛋白水平，暗示circNOLC1阻碍AZGP1蛋白降解（图2f）。此外，功能回复实验结果表明circNOLC1通过AZGP1活化mTOR/SREBP/G6PD信号通路来增强PPP（图2g和h）。

图2 circNOLC1通过与AZGP1互作影响葡萄糖摄取和mTOR/SREBP/G6PD信号（Ref. Fig4）

鉴于circrna通常作为miRNA海绵发挥作用，研究了circNOLC1是否可以在CRC进展过程中与miRNA结合。Anti-AGO2 IP分析发现circNOLC1富集（图3a）。通过生物信息学分析，发现有7个潜在的miRNA可与circNOLC1结合，其中miR-212-5p是一个报道与CRC转移相关的AI抑制因子，其表达水平在CRC细胞系中下调。circRIP实验发现circNOLC1和miR‐212‐5p在复合物中特异性富集，与生物素偶联的miRNA pull-down结果一致（图3b-c）。双荧光素酶实验结果也证实二者存在结合（图3d）。进一步实验显示抑制miR‐212‐5p上调c‐Met表达水平。

接下来，评估了circNOLC1在CRC中上调的原因。三个数据库预测均发现NOLC1启动子包含YY1的结合基序（图3e）。ChIP分析验证了YY1与NOLC1启动子直接结合（图3f），YY1上调circNOLC1水平（图3g）；同时circNOLC1促进HuR的表达部分增强了NOLC1 mRNA的稳定性（图3h-i）。

图3 circNOLC1作为miR‐212‐5p的海绵，上调c‐Met促进结直肠AI肝转移，YY1上调circNOLC1表达，circNOLC1通过HuR稳定NOLC1 mRNA（Ref. Fig5/6）

结论：本研究发现CircNOLC1促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和肝转移。机制上，CircNOLC1兼具circRNP和ceRNA功能，一方面，circNOLC1与AZGP1互作，活化mTOR/SREBP1信号通路，另一方面，circNOLC1吸附miR‐212‐5p上调c‐Met表达，诱导G6PD活化，在氧化戊糖磷酸途径介导的结直肠AI肝转移中发挥关键作用，可能为结直肠AI的个体化医疗提供新的靶点。另外，YY1可上调circNOLC1表达，circNOLC1促进HuR的表达增强NOLC1 mRNA的稳定性。