连云港细胞生物学实用膜片钳

膜片钳电生理技术的记录方式：全细胞记录法，膜穿孔记录法（perforatedpatchclamp），巨膜片钳记录法（giantmembranepatchclamp），松散封接记录法（loosepatchclamp）等技术应用：1.为了更换电极内液和从电极内施加药物，发展了微电极内灌技术（micropipetteperfusiontechnique）2.在研究细胞间的缝隙连接（gapjunction）通路时，发展了双膜片钳记录法（doublepatchrecording）3.将富含神经递质受体的游离膜片钳靠近突触部位，可检测递质释放和突触活动，这一技术称为膜片钳探针技术（detector-patchtechnique）4.将特异的膜片探针插入卵母细胞，可检测细胞内第二信使含量，此为膜片填塞技术（patchcrammingtechnique）5.为研究细胞的胞吞与胞吐机制，发展了膜电容测定法（membranecapacitancemeasurement）。膜片钳的应用：在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位施加各种浓度的药物来研究。连云港细胞生物学实用膜片钳

膜片钳使用的注意事项：工作原理膜片钳是一种能够直接观察单一的离子通道蛋白质分子对相应离子通透难易程度等特性的一种实验技术。它的基本原理是以一个光洁，直径约为0.5~3um的玻璃微电极同神经或肌细胞的膜接触，之后对微电极另一端开口处施加适当的负压用电极的纤细开口将与电极接触的那一小片膜轻度吸入，如此在微电极开口处的玻璃边沿以及这一小片膜周边会形成紧密的封接，它的电阻能够达到数个或数十个千兆欧，这世界上就是在化学上完全隔离了吸附在微电极开口处的那一片膜同膜的其余部分，通过微电极记录到的电流变化光光和该膜片中通道分子的功能状态相关联。膜片钳技术用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10~100MΩ的高阻封接，被孤立的小膜片面积为微米数量级，因此封接范围内细胞膜光有少数离子通道。连云港细胞生物学实用膜片钳膜片钳技术的应用范围：对单细胞形态与功能关系的研究。

膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。

膜片钳实验实验，记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析。对电极持续施加一个1mV、10～50ms的阶跃脉冲刺激，电极入水后电阻约4～6MΩ，此时在计算机屏幕显示框中可看到测试脉冲产生的电流波形。开始时增益不宜设得太高，一般可在1～5mV/pA，以免放大器饱和。由于细胞外液与电极内液之间离子成分的差异造成了液结电位，故一般电极刚入水时测试波形基线并不在零线上，须首先将保持电压设置为0mV，并调节“电极失调控制“使电极直流电流接近于零。用微操纵器使电极靠近细胞，当电极尖锐端与细胞膜接触时封接电阻指示Rm会有所上升，将电极稍向下压，Rm指示会进一步上升。通过细塑料管向电极内稍加负压，细胞膜特性良好时，Rm一般会在1min内快速上升，直至形成GΩ级的高阻抗封接。一般当Rm达到100MΩ左右时，电极尖锐端施加轻微负电压(-30～-10mV)有助于GΩ封接的形成。此时的现象是电流波形再次变得平坦，使电极超极化由-40到-90mV，有助于加速形成封接。为证实GΩ封接的形成，可以增加放大器的增益，从而可以观察到除脉冲电压的首尾两端出现电容性脉冲尖锐端电流之外，电流波形仍呈平坦状。膜片钳技术的应用范围：在心血管药理方面的研究。

膜片钳使用的注意事项：1.为了防止尘埃、静电伤害机器，每天做实验前请用清水拖地。2.拉制仪使用前需预热15-30min。3.银丝电极及地线发白时，请先用砂纸轻微打磨，再浸入新鲜的次氯酸钠溶液镀氯化银，如果银丝电极30min未变黑，则考虑更换次氯酸钠。4.先开放大器，后开软件；先关软件，后关放大器。5.非必须用到汞灯时请不要打开汞灯电源，打开后至少需1个小时才可关闭。6.在放大器打开时不能用手、金属物品或其它导电的物品接触电极丝（包括地线），在取放细胞片时请关闭放大器。膜片钳技术用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10~100MΩ的高阻封接，被孤立的小膜片面积为微米数量级，因此封接范围内细胞膜光有少数离子通道。膜片钳技术在可兴奋细胞如神经元、心肌细胞、肌纤维和胰腺细胞的研究中起至关重要的作用。莆田细胞生物学实用膜片钳研究方案

膜片钳在通道研究中的重要作用：利用膜片钳技术还可以用于药物在其靶受体上作用位点的分析。连云港细胞生物学实用膜片钳

膜片钳的数据如何处理：穿孔膜片(perforated patch)是为克服常规全细胞模式的胞质渗漏问题,有学者将与离子亲和的制霉菌素或二性霉素b经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上,形成只允许一价离子通过的孔,用此法在膜片上做很多导电性孔道,借此对全细胞膜电流进行记录。由于此模式的胞质渗漏极为缓慢,局部串联阻抗较常规全细胞模式高,所以钳制速度很慢,也称为缓慢全细胞模式。它适合于小细胞的电压钳位,对于直径大于30μm的细胞很难实现钳位。不足之处是由于电极与细胞间交换快,细胞内环境很容易破坏,因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分相同,如高k+,低na+和ca2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。膜片钳技术用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，使之形成10~100MΩ的高阻封接，被孤立的小膜片面积为微米数量级，因此封接范围内细胞膜光有少数离子通道。连云港细胞生物学实用膜片钳

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