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美国ultimainvestigator双光子显微镜成像技术

来源:因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 发布时间:2024年10月21日

光学显微镜从1590年发明以来,不断发展,促进生命科学日新月异的发现,帮助人类逐层打开生命本质的大门。同时,生命科学的发展不断给光学显微镜提出新的要求,促使成像理论和技术持续更新迭代。科学进入21世纪,人们已经不满足于在体外研究细胞和组织,需要能够更真实地探索生命,在体内实时观察细胞的发生和变化。此时,双光子显微镜进入了科学家的视野。在高光子密度的情况下,荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子,然后发射出一个波长较短的光子,其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的(图1)。如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),在单光子激发时,在波长为350nm光的激发下发出450nm荧光;而在双光子激发时,可采用700nm的激发光得到450nm荧光。双光子显微镜结合了双光子激发技术和激光扫描共聚显微镜。美国ultimainvestigator双光子显微镜成像技术

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由于具有较高输出功率的光源可以提高成像速度,在我们的实验中,时间分辨率主要是受OPO输出可见光激光功率的限制。尽管在单点扫描系统中,v2PE激发会使得空间分辨率提高,但多聚焦v2PE显微镜具有与1PE多聚焦显微镜近乎相同的横向分辨率,这主要是多聚焦成像和单点扫描技术之间的差异造成的。由于v2PE的激发体积小于1PE,引入图像扫描技术可以进一步提高空间分辨率,这种技术需要通过在阵列前引入额外的微透镜阵列来实现。除此之外,由于可见光区域的共振效应,可能会产生光漂白,因而为了延长观察时间,系统还需要对激发强度和曝光时间做进一步优化。美国ultimainvestigator双光子显微镜成像技术双光子显微镜可精确穿透较厚标本进行定点、有生命体的观察!

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与普通显微镜相比,电子显微镜可以在更小的尺度上观察事物,冷冻电子显微镜可以观察活性生物大分子。双光子显微镜有什么优势?它能做普通光学显微镜做不到的事情吗?原来双光子显微镜可以准确穿透厚标本进行定点和***观察!因为电磁波的波长越短,粒子越强,散射的影响越大。双光子显微镜将激发光源改为长波长激光,增加了激光的穿透力,同时降低了对细胞的毒性。此外,由于双光子激发效应只能发生在物镜的焦点处,因此扫描精度极高,还可以提高激发光效率,减少扫描点以外的荧光物质的消耗。

WinfriedDenk较初使用的光源是染料飞秒激光器(100fs脉宽、630nm可见光波长)。虽然染料激光器对于实验室演示尚可,但是使用很不方便所以远未实现商用。很快双光子显微镜的标配光源就变成了飞秒钛宝石激光器。除了固态光源优势,钛宝石激光器还具有较宽的近红外波长调谐范围,而近红外相比可见光穿透更深,对生物样品损伤更小。下图是Thorlabs的双光子和三光子显微镜配置,钛宝石飞秒可调谐激光器位于平台较左边。从双光子到三光子科学家正在从双光子转向三光子显微镜。1996年,ChrisXu在康奈尔大学(Denk同导师实验室)读博期间发明了三光子显微镜,如果双光子吸收可行,那么三光子看起来也是自然的发展方向。三光子成像使用更长的波长,大约在1.3和1.7微米,其成像深度也比双光子更深,目前记录约为2.2毫米,人类大脑皮层厚约4毫米。相比双光子显微镜,三光子还要求以较低重频使用更强和更短的激光脉冲,而传统的钛宝石激光器难以达到这些要求,但是对于掺镱光纤飞秒光参量放大器则非常容易,比如我们的Y-Fi光参量放大器(OPA)。双光子显微镜使用高能量锁模脉冲器。

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临研所、病理科和科研处邀请北京大学王爱民副教授在2020年12月22日做了题目为“新一代微型双光子显微成像系统介绍及其在临床医疗诊断”的学术报告。学术报告由临研所医学实验研究平台潘琳老师主持。王爱民,北京大学信息科学技术学院副教授,毕业于北京大学物理系,获学士、硕士学位,后于英国巴斯大学物理系获博士学位。该研究组研发的微型双光子显微镜,第1次在国际上获得了小鼠大脑神经元和神经突触清晰稳定的动态信号,该成果获得了2017年度“中国光学进展”和“中国科学进展”,并被NatureMethods评为2018年度“年度方法--无限制行为动物成像”。目前,该研究组正在研究新一代双光子显微成像技术在临床诊断中的应用,为未来即时病理、离体组织检测、术中诊断等提供新型的影像手段和分析方法。双光子显微镜使用长波长脉冲光,是通过物镜汇聚的。进口荧光激光双光子显微镜供应商

双光子显微镜为什么穿透能力强?美国ultimainvestigator双光子显微镜成像技术

双光子显微镜为什么穿透能力强?因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱,第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性,单光子激发的背景较强,所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率因为组织对可见光区域的较强吸收和散射带来两个严重的问题第1个是激发光的减弱,第2个就是另外就是由于物镜本身光的光学特性,单光子激发的背景较强,所以才有共聚焦系统提高成像的分辨率刚好双光子在这两点具有很大的优势上面的内容基本在谈到双光子优势都会相对说明,在实际操作中成像的深度和样品的关系很大,双光子成像利用高亮度的荧光标记材料,已经有做到mm级别的穿透深度美国ultimainvestigator双光子显微镜成像技术

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