美国单电极膜片钳细胞功能特性

在形成高阻抗封接后，记录实验结果之前，通常要根据实验的要求进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。需要注意的是，应恰当设置放大器的带宽，例如10kHz，这样在电流监测端将观察不到超越此频带以外的无用信息。膜片钳实验难度大、技术要求高，要掌握有关技术和方法虽不是很困难的事，但要从一大批的实验数据中，经过处理和分析，得出有意义、有价值的结果和结论，就显得不那么容易，有许多需要注意和考虑的问题，包括减少噪音，避免电极前端的污染，提高封接成功率，具体实验过程中还需要考虑如何选取记录模式，为记录特定离子电流如何选择电极内、外液，如何选择阻断剂、激动剂，如何进行正确的数据采集等许多更为复杂的问题，还需在科研实践中不断地探索和解决。封接是膜片钳记录的关键步骤之一。美国单电极膜片钳细胞功能特性

全细胞记录构型(whole-cellrecording) 高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录，或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。在电压钳条件下记录到的大细胞全细胞电流可达nA级，全细胞钳的串联电阻(玻管和细胞内部之间的电阻)应当补偿。任何流经膜的电流均流经这一电阻，所引起的电压降将使玻管电压不同于细胞内的真正电位。电流愈大，愈需对串联电阻进行补偿。全细胞钳应注意细胞必需合理的小到其电流能被放大器测到的范围(25～50nA)。减少串联电阻的方法是玻管尖要比单通道记录大。多通道膜片钳实验操作在细胞膜的电兴奋过程中，脂质层膜电容的反应是被动的，其电流电压曲线是线性的。

    把膜电位钳位电压调到-80--100mV，再用钳位放大器的控制键把全细胞瞬态充电电流调定至零位（EPC-10的控制键称为C-slow和C-series;Axopatch200标为全细胞电容和系列电阻）。写下细胞的电容值Cc和未补整的系列电阻值Rs，用于消除全细胞瞬态电流，计算钳位的固定时间（即RsCc），然启根据欧姆定律从测定脉冲电流的振幅算出细胞的电阻RC。缓慢调节Rs旋钮注意测定脉冲反应的变化，逐渐增加补整的比例。如果RS补整非常接近振荡的阈值，RS或Cc的微细变化都会达到震荡的阈值，产生电压的振荡而使细胞受损。因此应当在RS补整水平写不稳定阈值之间留有10%-20%的余地为安全。准备资料收集和脉冲序列的测定。

膜片钳技术的建立。抛光并填充玻璃管微电极，并将其固定在电极支架中。2.通过与电极支架连接的导管向微电极施加压力，直到电极浸入记录槽溶液中。3.当电极浸入溶液中时，给电极一个测量脉冲(命令电压，如5-10ms，10mV)读取电流，根据欧姆定律计算电阻。4.通过膜片钳放大器的控制键将微电极前端的连接电位调至零。这种电势差是由电极中的填充溶液和浸浴之间的不同离子成分的迁移引起的。5.用显微操作器将微电极前缘靠近直视下待记录的细胞表面，观察电流的变化，直至阻抗达到1gω以上，形成“干封”6。将静息膜电位调整到预期的钳制电压水平，这样当细胞没有钳制到零时，放大器可以从“搜索”变为“电压钳制”。用膜片钳技术，轻松捕捉离子通道的每一个细微动作！

电压钳的缺点∶电压钳技术目前主要用于巨火细胞的全细胞电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术不能替代的作用。但也有其致命的弱点1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细胞生理功能的完整性;2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的电流。3、对体积小的细胞（如哺乳类***元，直径在10-30μm之间）进行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将微电极的前列做得很细，如此细的前列致使电极阻抗很大，常常是60～-8OMΩ或120～150MΩ（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1μs）内向细胞内注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力。以膜片钳为钥匙，打开细胞离子通道研究的大门！美国单通道膜片钳解决方案

借助膜片钳技术，开启细胞膜离子通道的高精度研究之旅！美国单电极膜片钳细胞功能特性

    膜片钳技术∶从一小片（约几平方微米）膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定——电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。基本原理：利用负反馈电子线路，将微电极前列所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。研究离子通道的一种电生理技术，是施加负压将玻璃微电极的前列（开口直径约1μm）与细胞膜紧密接触，形成高阻抗封接，可以精确记录离子通道微小电流。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面朝内三种单通道记录方式，以及另一种记录多通道的全细胞方式。膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平**降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外，它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。 美国单电极膜片钳细胞功能特性