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单光子显微技术是较成熟的荧光显微技术，但由于其使用的激发光波长较短，成像深度有限；能量较大,会造成对荧光物质的漂白,光毒性严重。激光共焦扫描显微镜由于共焦显微镜的孔径很小,实现样本三维成像要逐点扫描,成像速度慢,对样本损害大,很难用于长时间活细胞成像。而宽场显微镜能够很好地实现实时动态成像,光漂白小,因而较早应用于活细胞内的实时检测，但宽场显微镜由于离焦信号的干扰,难以实现多维成像。双光子荧光显微镜（Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy）。双光子显微成像技术是近些年发展起来的结合了共聚焦激光扫描显微镜和双光子激发技术的一种新型非线性光学成像方法,采用长波激发，能对组织进行深层次成像。常用的比较好激发波长大多位于800-900nm，而水、血液和固有组织发色团对这个波段的光吸收率低，此外散射的激发光子不能激发样品，因此背景第，光损伤小，适用于在体检测。双光子荧光成像技术能准确定位细胞内置入的微电极位置，从而观察胞体、树突甚至单个树突棘的活性。研究者可完整的观察神经组织的分辨荧光图像,甚至可以分辨神经细胞单个树突棘中的钙分布。长时间追踪相同细胞，进行可重复的科学研究对自由行为动物进行慢性钙成像研究。合肥钙成像哪里买

功能光学成像技术的发展使研究脑区和神经元的内部工作成为可能。随着功能光学成像技术的发展，神经学家们已经可以研究脑区和神经元内部的工作情况。功能钙成像技术就是其中之一，其主要原理是将外源性荧光信号和生理现象耦合起来——通过荧光染料信号的改变反映细胞内游离钙离子浓度，以此表示细胞的功能状态。目前它被广泛应用于实时监测一群相关神经元内钙离子的变化，从而判断其功能活动。该技术的出现使得科学家可以亲眼目睹神经信号在神经网络之中时间和空间上的传递穿梭。美国在体钙成像生产厂家随着荧光显微镜技术的迅速发展，在体钙成像技术得到了蓬勃发展。

在神经系统研究中，我们常使用钙指示剂表征钙离子浓度变化，以反映神经元的活动。常见的钙成像方法有双光子荧光成像和单光子荧光成像两种，其中后者是研究脑神经活动的常用方法。但与双光子成像相比，单光子成像更易受到来自神经元的高水平串扰，导致信噪比降低。不仅如此，采集活动信号时还易被来自近距离通过的轴突和树突的信号所污染，造成的非特异性信号，这些均严重影响对神经元活动反应的精细成像。因而，在单光子荧光成像的基础上，研究团队在细胞核中表达遗传编码的钙指示剂，从而消除神经纤维信号。但与经典的胞质钙成像相比，钙进入细胞核的要求降低了这种成像的时间精度。

包含钙离子指示剂的细胞可以通过荧光显微镜(fluorescencemicroscope)观测，然后通过CCD摄像机捕捉、记录图像。现在钙成像技术主要在以下几类神经科学研究方面有广泛应用：1.记录培养的神经元的活动。2.记录脑片上神经元的活动。记录神经元的活动。由于离体实验本身的限制，现在越来越多的神经方面科学家倾向于做在体钙成像实验，希望能得到更准确且更能反应生理状况的数据。得益于双光子荧光显微镜的发展，现在在实验动物处于huoti状态下的钙成像技术取得了飞速进展。4.记录神经元树突和树突棘（spine）的活动。由于对于实验精度的要求，有些科学家不仅只想记录单个神经元的反应，他们还想更确切地知道神经元上哪些树突和树突棘参与了某个行为，也就是说他们需要在huoti条件下，对单根树突以及某些spine进行钙成像记录实验。由于双光子荧光显微镜和GCaMP6基因编码钙离子指示剂的发展，现在，对树突和树突棘用钙成像实验进行记录也成为了可能。对钙离子的功能研究中，钙指示剂是必不可少的工具。

现在有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。（A）单细胞注射法；（B）networkloading法；（C）通过病毒转染使其基因编码钙离子指示剂（expressionofgeneticallyencodedcalciumindicators,GECI）现在钙成像技术使用的钙离子指示剂主要有化学性钙离子指示剂和基因编码钙离子指示剂。上海超微显微钙成像nVoke2.0

钙离子成像可以追踪神经元动作电位。合肥钙成像哪里买

指示剂是如何负载细胞，目前有三种在神经元上填充钙离子指示剂的方法，且都可以用于体内和体外研究。第一种方法是利用玻璃吸管将膜渗透性盐或葡聚糖形式的指示剂注入单个神经元中。此方法方便实验者控制单个神经元内的钙离子指示剂浓度且信噪比较高。第二种是利用“批量加载”的方法将钙离子指示剂染料负载神经元，观察对象为一群神经元。尽管此方法可能导致一些胶质细胞也被指示剂所标记，但明显提高了整体神经元的标记百分比，使研究者得以观察到一群神经元内动作电位相关性的活动。第三种也较为常用，通过病毒转染的方式使其基因编码钙离子指示剂。合肥钙成像哪里买